HPLC là gì? Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của sắc ký lỏng HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được xem là một trong những phương pháp phân tích quan trọng trong lĩnh vực thử nghiệm và nghiên cứu hiện nay. Nhờ độ chính xác cao và khả năng phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường và hóa chất. Vậy HPLC là gì? Có cấu tạo như thế nào? Và nguyên lý hoạt động ra sao? Cùng tìm hiểu chi tiết trong bài viết sau bạn nhé.

1. Tổng quan về sắc ký lỏng HPLC

1.1. HPLC là gì?

HPLC (High Performance Liquid Chromatography), hay còn gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao, là một phương pháp phân tích hóa học được sử dụng để tách, nhận diện và định lượng các hợp chất có trong mẫu thử. Phương pháp này hoạt động dựa trên sự khác biệt về khả năng tương tác của các chất với pha tĩnh và pha động, từ đó cho phép phân tách các thành phần trong hỗn hợp một cách hiệu quả.

Nhờ độ chính xác cao, độ nhạy tốt và khả năng phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, môi trường, hóa chất và nghiên cứu khoa học.

>> Có thể bạn quan tâm: Thử nghiệm hàm lượng chất lưu huỳnh dễ bay hơi bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC |Tiêu chuẩn ASTM C471

>> Có thể bạn quan tâm: Tất tần tật Từ A – Z về Hệ thống sắc ký khí GC-FID

1.2. Lịch sử hình thành của HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được phát triển từ kỹ thuật sắc ký cột cổ điển do nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet đề xuất vào đầu thế kỷ XX. Mặc dù sắc ký cột truyền thống có khả năng phân tách các hợp chất trong hỗn hợp, nhưng quá trình phân tích thường kéo dài và hiệu suất tách còn hạn chế.

Đến cuối những năm 1960, cùng với sự phát triển của khoa học vật liệu và công nghệ chế tạo thiết bị, các nhà khoa học đã cải tiến phương pháp sắc ký lỏng bằng cách sử dụng hạt nhồi cột có kích thước nhỏ hơn và hệ thống bơm áp suất cao để tăng hiệu quả phân tách. Đây được xem là nền tảng cho sự ra đời của kỹ thuật HPLC hiện đại.

Năm 1970, thuật ngữ HPLC (High Performance Liquid Chromatography) được giáo sư Csaba Horváth sử dụng trong các công bố khoa học nhằm mô tả kỹ thuật sắc ký lỏng ứng dụng áp suất cao để đưa pha động đi qua cột sắc ký. Trong giai đoạn đầu, hệ thống HPLC hoạt động ở áp suất khoảng 500 psi và được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao (High Pressure Liquid Chromatography). Sau đó, nhờ những cải tiến về bơm, cột sắc ký, bộ tiêm mẫu và đầu dò, áp suất làm việc của hệ thống đã tăng lên hàng nghìn psi, giúp nâng cao đáng kể độ phân giải và tốc độ phân tích.

Ngày nay, HPLC đã trở thành một trong những kỹ thuật phân tích quan trọng nhất trong các phòng thử nghiệm hiện đại. Với độ chính xác cao, khả năng phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau và phạm vi ứng dụng rộng, HPLC được sử dụng phổ biến trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, môi trường, hóa chất và nghiên cứu khoa học.

1.3. Cấu tạo của máy HPLC – Sắc ký lỏng

Để thực hiện quá trình phân tách và phân tích các hợp chất một cách chính xác, hệ thống HPLC được cấu tạo từ nhiều bộ phận có chức năng riêng biệt nhưng hoạt động đồng bộ với nhau. Cụ thể gồm:

a. Bình chứa pha động (Mobile Phase Reservoir)

Bình chứa pha động là nơi lưu trữ dung môi hoặc hỗn hợp dung môi được sử dụng để vận chuyển mẫu qua hệ thống sắc ký. Pha động có thể là nước, methanol, acetonitrile hoặc các dung dịch đệm với thành phần được kiểm soát chặt chẽ nhằm đảm bảo khả năng phân tách của hệ thống. Trong các phương pháp gradient, HPLC thường sử dụng nhiều bình chứa để thay đổi thành phần pha động trong quá trình phân tích.

b. Bộ khử khí (Degasser)

Khí hòa tan trong dung môi có thể tạo thành bọt khí khi hệ thống hoạt động ở áp suất cao, gây dao động đường nền và ảnh hưởng đến độ chính xác của phép đo. Bộ khử khí có nhiệm vụ loại bỏ oxy, nitơ và các khí hòa tan khác trước khi pha động đi vào bơm cao áp. Hiện nay, hầu hết các hệ thống HPLC đều sử dụng bộ khử khí chân không trực tuyến (Online Vacuum Degasser).

c. Bơm cao áp (High Pressure Pump)

Bơm cao áp là bộ phận tạo lực đẩy giúp pha động di chuyển qua cột sắc ký với lưu lượng ổn định và áp suất có thể đạt hàng nghìn psi. Độ chính xác của bơm ảnh hưởng trực tiếp đến thời gian lưu, độ lặp lại và khả năng định lượng của phép phân tích. Các hệ thống HPLC hiện đại thường sử dụng bơm piston kép nhằm giảm dao động lưu lượng và duy trì áp suất ổn định trong suốt quá trình vận hành.

d. Bộ phận tiêm mẫu (Injector)

Bộ phận tiêm mẫu có nhiệm vụ đưa một thể tích mẫu xác định vào dòng pha động trước khi đi vào cột sắc ký. Thể tích tiêm thường nằm trong khoảng vài microlit đến vài chục microlit tùy theo yêu cầu phân tích. Hệ thống Autosampler hiện đại cho phép tiêm mẫu tự động với độ chính xác và độ lặp lại cao, đồng thời hỗ trợ phân tích hàng loạt mẫu liên tục.

e. Cột sắc ký (Chromatographic Column)

Cột sắc ký được xem là trung tâm của hệ thống HPLC và là nơi diễn ra quá trình phân tách các hợp chất. Bên trong cột chứa pha tĩnh được tạo thành từ các hạt vật liệu có kích thước rất nhỏ, thường là silica biến tính. Dựa trên sự khác biệt về mức độ tương tác giữa các chất với pha tĩnh và pha động, các cấu tử trong mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách riêng trước khi đến đầu dò.

f. Đầu dò (Detector)

Đầu dò có chức năng phát hiện các hợp chất sau khi được tách khỏi cột sắc ký và chuyển đổi chúng thành tín hiệu điện. Tùy thuộc vào tính chất của chất phân tích, hệ thống có thể sử dụng các loại đầu dò khác nhau như UV-Vis, PDA, huỳnh quang (FLD), chỉ số khúc xạ (RID) hoặc khối phổ (MS). Trong đó, đầu dò UV-Vis là loại được sử dụng phổ biến nhất nhờ độ nhạy cao và khả năng ứng dụng rộng rãi.

g. Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu (Data System)

Tín hiệu từ đầu dò được truyền đến phần mềm chuyên dụng để xử lý và xây dựng sắc ký đồ. Dựa trên diện tích pic, chiều cao pic và thời gian lưu, hệ thống sẽ tính toán hàm lượng các chất có trong mẫu. Đây là cơ sở để thực hiện các phép phân tích định tính và định lượng.

h. Hệ thống hiển thị và xuất báo cáo

Sau khi xử lý, dữ liệu được hiển thị dưới dạng sắc ký đồ và các bảng kết quả trên máy tính. Người vận hành có thể lưu trữ, truy xuất, thống kê hoặc xuất báo cáo phân tích phục vụ công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm và kiểm soát chất lượng.

2. Nguyên lý hoạt động của hệ thống sắc ký lỏng HPLC

Nguyên lý hoạt động của HPLC dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử giữa pha động và pha tĩnh. Trong quá trình phân tích, mẫu được đưa vào dòng pha động và được bơm qua cột sắc ký dưới áp suất cao. Bên trong cột chứa pha tĩnh, thường là các hạt silica hoặc vật liệu hấp phụ đã được biến tính bề mặt.

Khi đi qua cột sắc ký, các cấu tử trong mẫu sẽ tương tác với pha tĩnh ở mức độ khác nhau. Những chất có ái lực mạnh với pha tĩnh sẽ bị giữ lại lâu hơn, trong khi các chất có ái lực thấp sẽ được pha động cuốn đi nhanh hơn. Sự khác biệt về hệ số phân bố này làm cho các cấu tử được tách riêng và lần lượt đi ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau.

Các cấu tử sau khi được phân tách sẽ đi qua đầu dò (Detector) để chuyển đổi thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được hệ thống phần mềm xử lý và biểu diễn dưới dạng sắc ký đồ (Chromatogram), là cơ sở để thực hiện phân tích định tính và định lượng các chất có trong mẫu thử.

3. Có mấy loại HPLC?

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) được phân loại dựa trên cơ chế tách của pha tĩnh và tương tác với chất phân tích. Dưới đây là các nhóm phổ biến:

3.1. HPLC pha thuận (Normal Phase HPLC – NP-HPLC)

Đây là phương pháp tách dựa trên độ phân cực của chất phân tích.

• Pha tĩnh: có tính phân cực cao (thường là silica, alumina)
• Pha động: không phân cực hoặc kém phân cực (hexane, chloroform, ethyl acetate…)

Nguyên lý hoạt động:

Các chất phân cực sẽ bị giữ lại lâu hơn trên cột do tương tác mạnh với pha tĩnh, trong khi các chất kém phân cực sẽ đi ra trước.

3.2. HPLC pha đảo (Reverse Phase HPLC – RP-HPLC)

Đây là dạng HPLC được sử dụng phổ biến nhất hiện nay.

• Pha tĩnh: không phân cực (kỵ nước), thường là C18, C8
• Pha động: phân cực như nước, methanol, acetonitrile

Nguyên lý hoạt động:

Các chất kém phân cực sẽ được giữ lại lâu hơn, còn chất phân cực sẽ rửa giải nhanh hơn do ít tương tác với pha tĩnh.

3.3. HPLC loại trừ kích thước (Size Exclusion Chromatography – SEC)

Phân tách dựa trên kích thước phân tử thay vì tương tác hóa học.

• Pha tĩnh: vật liệu có lỗ xốp kiểm soát kích thước
• Không có tương tác hóa học đáng kể giữa chất phân tích và cột

Nguyên lý:

• Phân tử lớn → không đi vào lỗ xốp → rửa giải nhanh
• Phân tử nhỏ → đi vào lỗ xốp → rửa giải chậm hơn

Phương pháp này thường dùng cho protein, polymer, polysaccharide.

3.4. HPLC trao đổi ion (Ion Exchange HPLC)

Dựa trên tương tác điện tích giữa chất phân tích và pha tĩnh.

• Pha tĩnh: mang điện tích dương hoặc âm
• Pha động: dung dịch đệm (buffer) có kiểm soát pH và lực ion

Nguyên lý:

• Chất mang điện trái dấu với pha tĩnh sẽ bị giữ lại
• Điện tích càng mạnh → thời gian lưu càng dài

Ứng dụng: phân tích amino acid, protein, ion vô cơ…

3.5. HPLC tương tác kỵ nước (HILIC – Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)

Đây là dạng mở rộng, ngày càng được sử dụng nhiều.

• Pha tĩnh: phân cực mạnh
• Pha động: hỗn hợp acetonitrile và nước (tỷ lệ cao acetonitrile)

Nguyên lý:
Dựa trên tương tác giữa các chất ưa nước (hydrophilic) với lớp nước mỏng trên bề mặt pha tĩnh.

Ứng dụng: phân tích đường, nucleotide, chất chuyển hóa phân cực.

3.6. HPLC ái lực (Affinity HPLC)

Là phương pháp có độ chọn lọc cao nhất.

• Pha tĩnh: gắn ligand đặc hiệu (enzyme, kháng thể, receptor…)
• Chất phân tích: chỉ những phân tử có “tương thích sinh học” mới bị giữ lại

Nguyên lý:

Dựa trên tương tác sinh học đặc hiệu kiểu “khóa – chìa khóa”.

Ứng dụng: protein, enzyme, thuốc sinh học.

4. Ưu điểm và nhược điểm khi thử nghiệm bằng phương pháp HPLC

Mặc dù được đánh giá cao về khả năng phân tích và định lượng, phương pháp HPLC vẫn tồn tại những ưu điểm và hạn chế riêng mà doanh nghiệp cần nắm rõ trước khi lựa chọn áp dụng

4.1. Ưu điểm 

• Độ chính xác và độ nhạy cao: Có khả năng phát hiện và định lượng các chất ở nồng độ thấp, cho kết quả đáng tin cậy.
• Khả năng phân tách tốt: Tách hiệu quả nhiều hợp chất có trong cùng một mẫu, kể cả các chất có cấu trúc tương tự nhau.
• Ứng dụng đa dạng: Phù hợp với nhiều lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm, môi trường và hóa chất.
• Thời gian phân tích nhanh: Rút ngắn thời gian thử nghiệm so với nhiều phương pháp phân tích truyền thống.
• Định tính và định lượng đồng thời: Vừa xác định được thành phần, vừa xác định được hàm lượng chất cần phân tích.

4.2. Nhược điểm

• Chi phí đầu tư cao: Thiết bị, cột sắc ký và vật tư tiêu hao có giá thành tương đối lớn.
• Yêu cầu chuyên môn kỹ thuật: Cần đội ngũ kỹ thuật viên có kinh nghiệm để vận hành và xử lý dữ liệu.
• Tiêu tốn dung môi: Phát sinh chi phí dung môi và chi phí xử lý chất thải sau phân tích.
• Yêu cầu xử lý mẫu cẩn thận: Mẫu không đạt yêu cầu có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả và tuổi thọ thiết bị.
• Chi phí bảo trì định kỳ: Thiết bị cần được hiệu chuẩn và bảo dưỡng thường xuyên để duy trì độ ổn định.

5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thử nghiệm bằng phương pháp HPLC

Kết quả phân tích bằng HPLC có độ chính xác cao hay không phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong quá trình chuẩn bị mẫu, vận hành thiết bị và xử lý dữ liệu. Một số yếu tố quan trọng gồm:

• Chất lượng và độ đồng nhất của mẫu thử: Mẫu không đồng nhất hoặc bị nhiễm bẩn có thể làm sai lệch kết quả phân tích.
• Quá trình xử lý mẫu: Các bước chiết, hòa tan, lọc hoặc pha loãng mẫu không phù hợp có thể làm mất hoặc biến đổi chất phân tích.
• Thành phần pha động: Loại dung môi, tỷ lệ phối trộn và độ tinh khiết của pha động ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng phân tách các chất.
• Đặc tính của cột sắc ký: Loại cột, kích thước cột, kích thước hạt nhồi và tình trạng cột có tác động lớn đến hiệu quả phân tách.
• Tốc độ dòng pha động: Tốc độ dòng quá cao hoặc quá thấp có thể làm giảm độ phân giải và ảnh hưởng đến thời gian lưu của các chất.
• Nhiệt độ cột sắc ký: Sự thay đổi nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của hệ thống và khả năng tách các hợp chất.
• Thể tích mẫu bơm vào hệ thống: Thể tích tiêm mẫu không phù hợp có thể gây hiện tượng quá tải cột hoặc làm giảm độ nhạy của phép thử.
• Hiệu chuẩn và tình trạng thiết bị: Thiết bị không được hiệu chuẩn hoặc bảo trì định kỳ có thể làm giảm độ chính xác của kết quả phân tích.
• Chất lượng chất chuẩn: Độ tinh khiết và độ ổn định của chất chuẩn ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả định lượng.
• Điều kiện môi trường phòng thử nghiệm: Nhiệt độ, độ ẩm, độ rung và nguồn điện không ổn định có thể tác động đến hoạt động của thiết bị HPLC.
• Năng lực của người vận hành: Kinh nghiệm và kỹ năng của kỹ thuật viên đóng vai trò quan trọng trong việc thiết lập phương pháp, xử lý mẫu và đánh giá kết quả.
• Thông số cài đặt của đầu dò (Detector): Bước sóng, độ nhạy và các thông số thu nhận tín hiệu cần được thiết lập phù hợp với từng chỉ tiêu phân tích.

6. Ứng dụng rộng rãi của phương pháp HPLC

Nhờ khả năng phân tách, định tính và định lượng chính xác các hợp chất trong mẫu, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

6.1. Ứng dụng trong ngành dược phẩm và y sinh 

Trong ngành dược, HPLC là tiêu chuẩn vàng bắt buộc phải có để kiểm soát chất lượng từ khâu nguyên liệu thô đến thành phẩm.

• Kiểm nghiệm thuốc: Định lượng chính xác hàm lượng hoạt chất (API) trong thuốc viên, thuốc tiêm, siro… đảm bảo đúng tiêu chuẩn đăng ký.

• Thử nghiệm độ ổn định và tạp chất: Phát hiện và định lượng các tạp chất sinh ra trong quá trình bảo quản thuốc hoặc các sản phẩm phụ trong quá trình tổng hợp hóa học (ngay cả ở hàm lượng cực vết).

• Phân tích sinh học (Bioanalysis): Định lượng nồng độ thuốc hoặc các chất chuyển hóa trong máu, nước tiểu, mô của bệnh nhân nhằm phục vụ thử nghiệm lâm sàng và giám sát điều trị (TDM).

6.2. Ứng dụng trong kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và thức ăn chăn nuôi 

HPLC đóng vai trò “lá chắn” bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng bằng cách phát hiện các chất độc hại hoặc kiểm tra chất lượng dinh dưỡng.

• Phát hiện độc tố tự nhiên: Phân tích các loại độc tố vi nấm (Aflatoxin trong ngũ cốc, Ochratoxin trong cà phê, chất độc trong hải sản…).

• Kiểm soát hóa chất cấm và tồn dư: Phát hiện tồn dư thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật, chất tăng trọng (như Salbutamol) trong thịt, thủy sản và nông sản.

• Định lượng thành phần dinh dưỡng: Xác định chính xác hàm lượng các Vitamin (A, B, C, D, E, K), axit amin, đường, hoặc các chất phụ gia (chất bảo quản, màu thực phẩm) có trong sản phẩm.

6.3. Kiểm định tiêu chuẩn vật liệu và hóa chất công nghiệp

Trong sản xuất công nghiệp và kiểm định chất lượng (QA/QC), HPLC giúp đánh giá độ tinh khiết của các hợp chất polyme, phụ gia và nguyên liệu đầu vào.

• Phụ gia và chất trợ màng: Phân tích cấu trúc, hàm lượng các chất phụ gia, chất chống oxy hóa trong các loại vật liệu polymer, chất dẻo.

• Hóa chất ngành xây dựng & sản xuất: Kiểm tra độ tinh khiết và thành phần của các hóa chất công nghiệp, chất hoạt động bề mặt, hoặc các phụ gia trợ nghiền, phụ gia bê tông.

6.4. Phân tích và giám sát môi trường 

Môi trường ngày càng phức tạp đòi hỏi các phương pháp có thể tách và phát hiện các chất ô nhiễm hữu cơ ở nồng độ siêu nhỏ.

• Giám sát nguồn nước: Phân tích các hợp chất hữu cơ độc hại bền vững (POPs), thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ trong nước thải công nghiệp, nước sinh hoạt và nước ngầm.

• Ô nhiễm không khí và đất: Xác định các hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs) – những tác nhân gây ung thư có trong khói bụi ô nhiễm, đất bị nhiễm độc.

6.5. Pháp y và hình sự 

Trong khoa học hình sự, kết quả từ HPLC (đặc biệt là khi kết nối với đầu dò khối phổ HPLC-MS) là bằng chứng pháp lý không thể chối cãi tại tòa án.

• Giám định chất cấm: Phân tích, nhận diện các loại ma túy, chất gây nghiện mới, thuốc độc trong các vụ án.

• Phát hiện doping: Kiểm tra nước tiểu và máu của các vận động viên thể thao để phát hiện các chất tăng cường thành tích bị cấm.

7. OPACONTROL cung cấp dịch vụ phân tích và thử nghiệm bằng phương pháp HPLC chuyên nghiệp

Việc lựa chọn đúng phương pháp thử nghiệm đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích. Với khả năng phân tách và định lượng hiệu quả nhiều hợp chất trong mẫu, HPLC hiện là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến tại các phòng thử nghiệm hiện đại.

Tại OPACONTROL, chúng tôi cung cấp dịch vụ phân tích và thử nghiệm bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đáp ứng nhu cầu đánh giá chất lượng và kiểm soát các chỉ tiêu hóa học theo yêu cầu của khách hàng. Hiện nay, OPACONTROL đang triển khai thử nghiệm hàm lượng lưu huỳnh bay hơi bằng phương pháp HPLC, phục vụ công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm và đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật theo tiêu chuẩn hiện hành.

Với hệ thống thiết bị hiện đại cùng đội ngũ chuyên gia và kỹ thuật viên giàu kinh nghiệm, OPACONTROL cam kết mang đến kết quả thử nghiệm có độ chính xác cao, thời gian thực hiện nhanh chóng và hỗ trợ khách hàng trong suốt quá trình đánh giá, thử nghiệm.

CÔNG TY TNHH TIÊU CHUẨN ĐO LƯỜNG OPACONTROL

Website: https://opacontrol.com.vn/

Email: opa@opacontrol.vn

Facebook: https://www.facebook.com/opacontrol

SĐT: 1800 6464 38 – 024 2206 1628